آزمون الكترونيكي كارگاه
منبع:سابت بیوتکنولوژی
+ نوشته شده در سه شنبه ۱۲ آبان ۱۳۸۸ ساعت 0:53 توسط H-E-G
|
درس پنجم
درس پنجم
14-P.C.I extraction
هدف از اين كار حذف پروتئنهاي موجود در محلول حاوي DNA ميباشد . فنل ( equilibrated phenol با pH بيشتر از 7.5) موجب دناتوده شدن پروتئنها ميشود و كلرفرم نيز بقاياي فنل را از محلول واكنش حذف ميكند .
1- هم حجم محلول حاوي DNA فنل اضافه كنيد و مدت 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد ( فنل متعادل شده به علت 8-hydroxyquinoline ماده آنتي اكسيدان ) زرد رنگ است و روي آن با يك لايه بافر تريس پوشانيده شده است هنگام استفاده از فنل زير بافر استفاده كنيد)
2- مايع رويي ( مايع شفاف ) را به لوله تميز ديگري انتقال دهيد ( فنل در زير قرار ميگيرد و پروتئنهاي دناتوره شده بين دو لايه قرار ميگيرند).
3- هم حجم آن از مخلوط كلرفرم - ايزو آميل الكل ( 1:24) اضافه كنيد( ايزو آميل الكل يك ماده Anti foam است و مانع كف كردن محلول ميشود ) و مانند مرحله قبل ادامه دهيد
4- مايع رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد ويا مانند روش زير ميتوان عمل نمود:
5- مخلوط فنل - كلرفروم - ايزو آميل الكل (به نسبت 1:24:25) تهيه كنيد
6- حجم مساوي از مخلوط P.C.I به محلول حاوي DNA اضافه كنيد و 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد
7- محلول رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد و هم حجم آن C.I اضافه كنيد و 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد
8- محلول رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد (محلول حاوي DNA است )
9- اگر هنوز بوي فنل از آن متصاعد ميشود مرحله 7 را تكرار كنيد.
10- DNA را با الكل رسوب دهيد( تغليظ DNA ).
15- رسوب DNA با الكل ( تغليظ DNA )
هدف از اين كار احياي DNA بعد از استخراج و يا بعد از P.C.I. extraction ميباشد و در مواقعي نيز كه DNA خيلي رقيق باشد بدينوسيله آن را تغليظ ميكنيم.
1- حجم محلول حاوي DNA را تعيين كنيد ( تخمين بزنيد )
2- استات سديم با غلظت نهايي 0.3M به آن اضافه كنيد .
3.- مقدار دوبرابر حجم آن الكل مطلق سرد ( 20- يا 70-) اضافه كنيد
4- مدت 10 دقيقه با 12000xg سانتريفيوژ كنيد . رسوب سفيد رنگ را ميتوان در ته لوله مشاهده نمود ( لازم به ذكر است كه DNA خالص تقريبا" بيرنگ است ).
5- . با وارونه كردن لوله , مايع رويي را حذف كنيد و لوله را بصورت وارونه روي كاغذ جاذب الرطوبه قرار دهيد تا آب آن حذف شود .
6- مقدار 100 ميكرو ليتر الكل 70 درجه به آن اضافه كنيد و آن را ورتكس كنيد تا رسوب DNA از ته لوله كنده شده و شناور گردد ( اگر DNA بزرگ با شد ورتكس موجب شكسته شدن آن ميشود) .
7- مدت 5 دقيقه آن را سانتريفيوژ كنيد ( شستن DNA)
الكل را خالي كرده و DNA را در 70 درجه خشك كنيد ( چنانچه در اين مرحله DNA خوب خشك نشود والكل همراه آب داخل آن بماند بعدا" براي كار كردن با آنزيمها دچار اشكال ميشويد). DNA را در مقدار بافر ( آب ) دلخواه حل كنيد .
16- احياي DNA از ژل آگارز
هدف از اين قسمت كسب مهارت براي احياي DNA از روي ژل آگارز ميباشد. اين تكنيك در بيولوژي مولكولي و مهندسي ژنتيك اهميت زيادي دارد و در كلونينگ و انتقال ژن استفاده ميشود لازم به ذكر است كه از طرق مختلف اين كار انجام ميشود مانندFreez- Squeez, paper elution, Electero elution , و... ولي فقط دو روش توضيح داده ميشود :
الف ) احياي DNA ازروي ژل توسط كاغذ ( paper elution )
1- DNA مورد نظر رابا ژل آگارز 1-2درصد الكتروفورز كنيد و اجازه دهيد تانوارهاي هاي DNA بخوبي از همديگر تفكيك شوند
2- با نور UV ( طول موج 254 نانومتر موجب آسب DNA ميشود و بهتر است از طول موج 312 نانومتر استفاده گردد ) نوارهاي مورد نظر را مشاهده كرده و جلو آن را با تيغ اسكالپر تميز علامت گذاري كنيد
3- در جلو band يك حفره ايجاد كنيد ( عرض حفره مساوي عرض band باشد )
4- يك قطعه كاغذ واتمن و يك قطعه كيسه دياليز ( dialysis tubing ) به اندازه حفره ببريد
5.- كاغذ واتمن را در جلو حفره و كيسه دياليز را در پشت كاغذ قرار دهيد
6- الكترو فورز را ادامه دهيد ( بافر تانك را كمتر كنيد بطوري كه روي ژل را نپوشاند )
7- وقتي DNA وارد كاغذ شد الكترو فورز را متوقف كنيد
8.- كاغذ را جمع كرده و به لوله 5/ ميلي ليتري كه انتهاي آن سواخ شده است انتقال دهيد
9. توسط سمپلر مقدار مناسب با فر
(150mM NaCl , 20mM Tris (pH=7.5) 1mM EDTA , 5%SDS) روي كاغذ بريزيد
10- لوله مذكور را داخل يك لوله بزرگتر قرار دهيد ( 5/1 ميلي ليتر ) ، سانتريفيوژ كنيد تا مايع از ته لوله كوچك به داخل لوله بزرگتر حركت كند ، چند دفعه اينكار را تكرار كرده تا موقعي كه ديگر DNA روي كاغذ واتمن مشاهده نشود ( با نور UV آزمايش شود )
11- اين بافر را جمع آوري كرده و با P.C.I استخراج كرده و با الكل تغليظ كنيد
ب) احياي DNA از روي ژل آگارزLow Melting Point (LMP)
1- DNA مورد نظر را با آگارز LMP 2درصد الكترو فورز كنيد و اجازه دهيد تا نوارهاي DNA خوب تفكيك شوند
2- با نور UV ( طول موج 254 نانومتر موجب اسيب DNA ميشود و بهتر است از طول موج 312 نانومتر استفاده گردد ) band مورد نظر را مشاهده كنيد
3- band مورد نظر را با تيغ اسكالپر تميز علامت گذاري كنيد
4- ژل را روي كاغذ سفيد قرار داده و band مورد نظر را بريده به لوله تميرديگر منتقل كنيد
5- قطعه ژل را يك شب در فريزر 20- درجه قرار دهيد
6- قطعه ژل را در حرارت اتاق قرار دهيد و سپس 5 دقيقه در آب 65 درجه انكوبه كنيد
7-آن را به حرارت اتاق منتقل كرده و دو مرتبه با P.C.I استخراج كنيد تا ژل از آن حذف شود
8.- استات سديم ( غلظت نهايي 0.3M ) اضافه كرده با الكل رسوب دهيد
+ نوشته شده در دوشنبه ۲۷ مهر ۱۳۸۸ ساعت 0:32 توسط H-E-G
|
درس چهارم
درس چهارم
براي تاييد انجام كارهاي مهندسي ژنتيك با يد تغييراتي كه روي DNA ايجاد شده است رويت گردند، مشاهده DNA متعافب الكتروفورز روي ژل آگارز يا پلي آكريلاميد و رنگ آميزي با اتيديوم برومايد امكان پذير خواهد بود. براي انتخاب درصد آگارز از جدول شماره 2 استفاده ميشود:
جدول شماره 2 - قدرت جداسازي مولكولهاي DNA توسط غلظتهاي مختلف آگارز
|
درصد آگارز |
قدرت جداسازي DNA |
|
3 |
100-1000bp |
|
2 |
200- 1500bp |
|
1.5 |
300- 3000bp |
|
1 |
500 – 5000bp |
|
0.8 |
1000- 7000bp |
|
0.6 |
10 – 30kbp |
|
0.4 |
30 – 50kbp |
12- تهيه ژل آگارز
1- قالب ژل را آماده كنيد
2- شانه اي با دنده هاي مناسب روي قالب قراردهيد
3- حجم ژل مورد نظر را تعيين كنيد ( اندازه گيري طول وعرض قالب و قطر ژل مورد نظر )
4- پودر آگارز را وزن كنيد
5- آگارز را در بافر 1xTBE حل كنيد و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنك شدن به ازاي هر 10 ميلي ليترژل يك ميكروليتر از محلول 10mg/ml اتيديوم برومايد اضافه كنيد سپس آن را خوب مخلوط كرده و داخل قالب بريزيد
1xTBE= 89mM Tris base, pH8, 89mM boric acid, 2.5mM EDTA, pH8
6- بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج كرده و داخل تانك الكتروفورز قرار دهيد
7- هر 5 ميكروليترنمونه را با يك ميكروليتر بافر نمونه مخلوط كرده و داخل چاهك هاي ژل بريزيد (اين بافر حاوي 50درصد ماده سنگين كننده مانند گليسرين يا ساكارز است كه نمونه بخوبي داخل چاهك ريخته ميشود و همچنين حاوي0.2 درصد از يك رنگ نشانه مانند بروموفنل بلو يا گزيلن سيانول ميباشد . رنگ برومو فنل بلودر ژل 1.5 درصد همراه با 500bp و درژل 0.8 درصد با 1000bpحركت ميكند )
جدول شماره 3 : مقايسه حركت رنگ نشانه و ماركر DNA روي ژل آگارز
|
درصد ژل آگارز |
حركت تقريبي رنگ نشانه در مقايسه با ماركر |
حركت تقريبي DNA در مقايسه با ماركر | |
|
برومو فنل بلو |
Xylen cyanol | ||
|
0.4 |
500bp |
3 kbp |
2.5 kbp |
|
0.8 |
500 bp |
3 kbp |
1kbp |
|
1 |
500bp |
3 kbp |
500 bp |
|
1.25 |
500 bp |
3 kbp |
250bp |
|
1.5 |
100bp |
1kbp |
250bp |
|
2 |
100bp |
1kbp |
100bp |
جدول شماره 4 : مقايسه حركت رنگ نشانه و ماركر DNA روي ژل پلي آكريلا ميد
|
درصد ژل پلي آكريلاميد |
حركت تقريبي رنگ نشانه در مقايسه با ماركر |
حركت تقريبي DNA در مقايسه با ماركر | |
|
برومو فنل بلو |
Xylen cyanol | ||
|
3.5 |
100bp |
500 bp |
100 bp |
|
5 |
75bp |
250bp |
75bp |
|
8 |
50bp |
250bp |
50 bp |
|
12 |
25bp |
75bp |
25bp |
|
15 |
10bp |
60bp |
25bp |
|
20 |
10bp |
60bp |
5bp |
8.- بافر تانك بايد كاملا" روي ژل را بپوشاند و نمونه ها از داخل بافردرون چاهك ها ريخته شوند. (از بافرهاي مختلف استفاده ميگردد. بهتر است هنگام الكتروفورز به ازاي هر ميلي ليتر بافر تانك (TBE buffer) يك ميكرو ليتر از اتيديوم برومايد 10mg/ml اضافه شود.
9- DNA داراي شارژ منفي است و براي الكتروفورز شدن بايد نمونه بطرف قطب منفي با شد تا هنگام الكترو فورز به سمت قطب مثبت حركت كند
10- تانك الكتروفورز را به منبع تغذيه وصل كنيد
11- پيچ Current را روي ماكزيمم قرار داده و ولتاژ را تنظيم كنيد (10V/centimetr )
وقتي رنگ نشانه سه چهارم طول ژل را طي كرد ژل را از تانك خارج كرده بانورUV نتيجه را مشاهده كنيد .
13- تهيه ژل پلي آكريلاميد :
قدرت تفكيك سازي اين ژل بسيار بالا است و قطعات DNA با طول كم نيز در اين ژل قابل رويت ميباشند و بسته به در صد ژل حتي اختلاف يك باز را ميتوان در قطعات DNA الكتروفورز شده مشاهده نمود .
1. شيشه ها، شانه ( Comb ) و فضاسازها ( Spacer) را با آب و دترژان خوب بشوييد و سپس با الكل 70 در صد آنهارا تميز كنيد تا چربي دستها روي آنها باقي نماند ( بجاي پنبه از گاز استفاده كنيد زيرا پرزهاي پنبه روي شيشه باقي ميمانند ) .
2. قالب ژل را آماده كرده و جهت جلوگيري از نشت ژل ازداخل آن اطراف آن را با آگارز 1در صد به دقت درز گيري (Seal) نماييد .
3. حجم قالب (cast ) را ( حجم ژل) با اندازه گيري طول وعرض قالب مشخص نماييد ( قطر ژل بسته به قطر فضا سازها يك و يا نيم ميليمتر است )
4. بسته به در صدژل مورد نظر مقدار آكريلاميد و بيس آكريلاميد لازم را (بصورت مخلوط 29 در صد آكريلاميد و 1درصد بيس آكريلاميد تهيه و در يحچال نگهداري ميشود) داخل لوله تميز بريزيد
5. از بافر 10xTBE با غلظت نهايي 1x اضافه كنيد وبا آب مقطر به حجم مورد نظر برسانيد
6. مقدار 100 ميكرو ليتر آمونيوم پرسولفات 10درصد و 3 ميكرو ليتر محلول TEMED به آن اضافه كنيد ( توجه داشته باشيد كه مونومرهاي اكريلاميد وبيس آكريلاميد در حال پليمريزه شدن هستند)
7. به آرامي محلول را در قالب از قبل آماده شده بريزيد و مراقب باشيد كه حباب هوا وارد آن نشود زيرا حباب هوا مانع انجام الكترو فورز ميشود .
8. به آرامي شانه را داخل قالب قرار دهيد تا بعد از پليمريزه شده ژل ، درون آن چاهك هايي جهت نمونه گذاري ايجاد شود
9. بعد از پليمريزه شده به آرامي شانه را درآورده و چاهك هارا با آب بشوييد تا اگر مونومرهاي پليمريزه نشده هنوزوجود دارد شسته شوند
10. گيره پاييني را باز كنيد وفضاساز پاييني را از قالب خارج كنيد
11. گيره هاي طرفين را باز كرده و دستگاه را طوري داخل تانك مخصوص قرار دهيدكه قسمت بريده شده شيشه رويي ( Notch ) به سمت محفظه بالايي ( تانك فوقاني) قرار گيرد
12. شيشه هاي دستگاه ( قالب) را با نصب گيره ها ي مخصوص به طرفين تانك , ثابت نماييد
13. محفظه هاي بالا و پايين تانك را با 1xTBE buffer پرنماييد بطوريكه بافر روي چاهك ها را بپوشاند. چنانچه بين دوشيشه قالب ( محل خارج كردن فضاساز پاييني ) كه در محفظه پاييني تانك قرار دارد حباب هوا مشاهده ميشود با يك سرنگ پر از بافر كه دار اي سر سوزن كج است حباب هوا را بيرون كنيد تا مانع جريان الكتريكي نشود و الكترو فورز بخوبي انجام گيرد
14. محصول PCR را ( همانند الكتروفورز با ژل آگارز) با بافر نمونه گذاري مخلوط كرده و توسط سرنگ هاميلتون نمونه گذاري را روي ژل انجام دهيد
15. محفظه بالايي تانك را به قطب منفي ومحفظه پاييني را به قطب مثبت منبع تغذيه وصل كرده و الكتروفورز كنيد
16. بعد ازخاتمه الكتروفورز ( وقتي رنگ نشانه به پايين ژل رسيد) جريان برق را قطع كرده و شيشه را از تانك جدا كنيد. با يك تيغه فلزي نازك به آرامي بين دو شيشه فشار آوريد تا دو شيشه از هم جداشوند . ژل به يكي از دو شيشه مي چسبد . به آرامي آنرا داخل آب حاوي 10 ميكروگرم درهرميلي ليتر اتيديوم برومايد قرار دهيد تا بعد از چند دقيقه ژل رنگ شود .
ژل را روي دستگاه UV Transilluminator قرار داده و نوارهاي هاي DNA را مشاهده كنيد.
+ نوشته شده در یکشنبه ۲۶ مهر ۱۳۸۸ ساعت 0:31 توسط H-E-G
|
درس دوم
درس دوم
2- بافر هاي مورد نياز در آزمايشگاه بيولوژي مولكولي
اولين وظيفه فرد در آزمايشگاه مولكولار بيولوژي تهيه بافر هاي مورد نياز ميباشد. همه واكنشهاي بيولوژي در بافر مخصوص انجام ميشوند . معمولا"مواد اصلي بافر هارا در آزمايشگاه بصورت ذخيره ((Stock تهيه ميكنند و بافر هاي مورد نياز روزانه را از مواد ذخيره تهيه مينمايند . بعضي از مواد ذخيره و مولاريته آنهابه اين شرح است:
|
نام ماده |
مولاريته ( غلظت ) |
نام ماده |
مولاريته ( غلظت) |
|
Ammonium Acetate |
10M |
NaCl |
5M |
|
Tris pH ( 8, 7.5 , 7.4) |
1M |
CaCl2 |
1M |
|
NaOH |
5N |
EDTA |
0.5M |
|
Ethidium bromide |
1mg/ml |
SDS |
10% |
|
X-gal |
20mg/ml |
KAc |
5M |
|
IPTG |
200mg/ml |
NaAc |
3M |
براي تهيه محلول كار از مواد ذخيره از فرمول زير استفاده ميشود
M1V1=M2V2
M1 مولاريته ماده ذخيره V1حجم ماده ذخيره كه بايد براي بافر برداشته شود
M2مولاريته بافر موردنياز V2حجم بافرخواسته شده
مثلا" براي تهيه 50 ميلي ليتر TE بافر ( 10 ميلي مولار تريس و 1ميلي مولار EDTA ) چنين عمل ميكنيم :
50x10 = ?x1000, 500:1000= 0.5cc ( 500 μl) Tris
50x1 = ? x500 , 50:500 = 0.1cc ( 100μl ) EDTA
روش كار: 500μl از بافر تريس و 100μl از EDTA را درظرف مدرج ( لوله فالكن ) ريخته و حجم آن را به 50ml ميرسانيم .
3- تهيه محيط LB brothبراي كشت باكتري ( E.coli )
هدف از آموزش اين قسمت تهيه محيط مايع براي كشت با كتريهاي مورد استفاده در كار هاي بيولوژي مولكولي ميباشد
1- مواد زير را وزن كرده درون ارلن ماير ريخته و روي Stirrer مخلوط كنيد
تريپتون 5/2 گرم سديم كلرايد5/2 گرم
عصاره مخمر25/1 گرم آب مقطر250 ميلي ليتر
2- pH محيط را مساوي 5/7-7 تنظيم كنيد و سپس آن را اتوكلاو نماييد. مقدار لازم از آن را درون لوله مناسب ريخته ( در صورت نياز آنتي بيوتيك مناسب به آن اضافه نماييد ) و بصورت استريل ( كنار شعله ) يك كلني از سلول مورد نظر را درآن كشت داده ويك شب در 37 درجه آن را Shake كنيد.
4- تهيه آگار پليت
هدف از انجام اين كار تهيه محيط كشت جامد براي كشت باكتريها ميباشد.
به محيط LB مقدار 5/1 درصد وزني پودر آگارآگار اضافه كرده وروي شعله قرار دهيد تا خوب بجوشد تا آگار كاملا" حل شده ومحلول شفاف بدست آيد سپس آن را اتوكلاو كنيد.
مقدار 100μg / ml آمپي سيلين ( يا هر آنتي بيوتيك مناسب ديگر ) به آن اضافه كنيد.
محيط را داخل چند پليت تقسيم كرده و در حرارت اتاق قرار داده تا آگار سفت شود سپس آنها را لاي كاغذ پيچيده و تا هنگام استفاده دربرودت 4 درجه نگهداري نماييد.
5- تهيه آنتي بيوتيك هاي مورد نياز كارگاه :
الف ) 500mg آمپي سيلين ( يك ويال) رادر 5 سي سي آب مقطراستريل حل كنيد غلظت آن100mg/ml است و هر ميكرو ليتر اين محلول حاوي 100μg آمپي سيلين است .آمپي سيلين با غلظت نهايي 100μg/ml مصرف ميشود. براي هر ميلي ليتر محيط كشت ( LB broth يا آگار پليت ) يك ميكروليتر از اين محلول استفاده ميشود.
ب) تتراسيكلين ( ويال يا كپسول ) را با غلظت 25mg/ml در متانول حل كنيد و در لوله هاي يك ميلي ليتري تقسيم كرده فريزر كنيد. اين آنتي بيو تيك با غلظت نهايي 12.5μg/ml مصرف ميشود . براي هر ميلي ليتر محيط كشت( LB broth يا آگار پليت ) 0.5 ميكروليتر از اين محلول استفاده ميشود ( ميتوان محلول ذخيره تتراسيكلين را با غلظت 12.5mg/ml تهيه نمود سپس براي هر ميلي ليتر محيط يك ميكروليتر از ملول ذخيره اضافه نمود).
6- تهيه سلول پذيرا ( Competent cell )
هدف ازآموزش اين قسمت كسب مهارت براي تهيه سلول باكتري است بطوري كه طي پروسه اي كه روي آن انجام ميگيرد باكتري زنده بماند و پلاسميد (Circular DNA ) بتواند وارد آن شود. سرما وكلسيم كلرايد و متعاقب آن شوك گرمايي ( Heat shock) كه به سلول وارد ميشود تغييراتي در سطح سلول ايجاد ميشود وDNA پلاسميدي از طريق مناقذي كه روي سطح سلول ابجاد شده اند وارد آن ميگردد.
روش كار:
1- يك كلني از باكتري مورد نظر را در 3 ميلي ليتر محيط LB كشت داده ويك شب در 37 درجه روي شيكرانكوبه كنيد
2. يك حجم از كشت شبانه باكتري مورد نظر رادر ده حجم محيط LB كشت دهيد ( بنا به دلايلي كه بعدا" توضيح داده ميشود در اين كارگاهها از دو سويه HB101 و XL1-blue باكتري E.coli كه خصوصيات آنها نيز توضيح داده خواهد شد استفاده ميگردد)
3. مدت2.5ساعت در حرارت و rpm مناسب آن را Shake كنيد تا به OD600 = 0.6 برسد
4. مقدار يك ميلي ليتر آن را به لوله ميكروفيوژ انتقال دهيد
5. لوله حاوي سلول را ده دقيقه روي يخ قرار دهيد
6. مدت 5 دقيقه با 3500rpm سانتريفيوژ كنيد ( بهتر است در 4درجه انجام شود )
7. مايع رويي را خالي كرده ولوله را وارونه روي كاغذ جاذب الرطوبه قرار دهيد تا آب آن خارج شود
8. رسوب را بايك سوم حجم اوليه از محلول 100mM CaCl2 سوسپانسيون كنيد ( محلول نبايد ورتكس شود بلكه با ضربه انگشت آن را حل كنيد) و ده دقيقه روي يخ قرار دهيد
9. مانند مرحله 5 آن را سانتريفيوژ كرده محلو ل رويي را خالي كنيد
10. رسوب را با يك دوازده ونيم حجم اوليه محلول CaCl2 سوسپانسيون كنيد ( با ضربه دست )
آن را درون ميكروفيوژ هاي مناسب تقسيم كرده وبراي Transformation استفاده كنيد.
7- Transformation ( انتقال Plasmid DNA به باكتري زنده )
هدف از آموزش اين قسمت كسب مهارت لازم براي انتقال پلاسميد به سلول باكتري ميباشد . اين كار در بيولوژي مولكولي از اهميت بالايي بر خوردار است . براي كار كردن با ژنها بايد حتما" آن ژن در يك پلاسميد كلون شود و سپس پلاسميد نوتركيب (Recombinant plasmid) به سلول باكتري منقل شود تاپس از همانند سازي پلاسميد، ژن ( DNA ) كلون شده در پلاسميد نيز به تبع آن همانند سازي كند .
1. سلول پذيرا ( Competent cell ) را روي يخ قرار دهيد
2. Plasmid DNA مورد نظر را (5ng) به آن اضافه كرده خوب مخلوط كنيد ( بنا به دلايلي كه بعدا" توضيح داده ميشود دراين كارگاهها از دوپلاسميد pBR322 وBluescript كه خصوصيات آنها نيز توضيح داده خواهد شد استفاده ميگردد)
3. - لوله حاوي سلول پذيرا ( Competent cell ) را مدت 30 دقيقه روي يخ قرار دهيد
4.- واكنش را مدت 40 ثانيه در آب گرم 42 درجه قرار دهيد ( شوك گرما )
5.- مدت 2-1 دقيقه روي يخ قرار دهيد
6-. مقدار 200 ميكروليتر محيط LB ( بدون آنتي بيوتيك) به آن ضافه كرده و 60-40 دقيقه در 37 درجه انكوبه كنيد (باكتر ي E.coli هر 20 دقيقه يك نسل تكثير ميكند ودر اينجا به آن فرصت داده ميشود تا دو يا سه نسل تكثيرنمايد ) . .
7- بصورت زير روي آگار پليت پخش كنيد ( توجه : همه محتواي لوله را روي پليت خالي كرده و با Spreader آن را روي سطح آگار داخل پليت پخش كنيد):
پليتA : Competent cell+ plasmid DNA و آنتي بيوتيك مناسب
پليت: B Competent cell ( آگار حاوي آنتي بيوتيك است )
پليتC : Competent cell ( آگار فاقد آنتي بيوتيك است )
8.- پليت را به انكوباتور منقل كرده ودرب آنها را نيمه باز بگذاريد تاسطح پليتها خشك شود
9- . پليت هارا بصورت وارونه يك شب در حرارت 37 درجه انكوبه كنيد
10- اگر پروسه كار خوب انجام شده باشد بعد از 12 ساعت روي سطح پليت كلني ها ظاهر ميشوند
11- تفسير نتايج : اگر كار درست انجام شده باشد بايد روي پليت هاي A و C كلني باكتري رشد كرده باشد ولي روي پليت B كلني باكتري مشاهده نگردد رشد كلني باكتريايي روي پليت B به اين معني است كه باكتري مورد استفاده قبلا"با يك پلاسميد حاوي ژن مقاومت به آنتي بيوتيك ترانسفرم شده است در اينصورت كلني هايي كه روي پليت A ظاهر شده اند فاقد اعتبار ميباشند . اگر روي پليت C كلني با كتر ي رشد نكند به اين معني است كه Competent cell خراب بوده و باكتريها در طول پروسه كار مرده اندو نبايد انتظار داشته با شيم كه روي پليت A هم كلني باكتري رشد كند .كلني هاي باكتريايي كه روي پليت A رشد ميكنند كلني هاي حاوي پلاسميد مورد نظر هستند.
+ نوشته شده در دوشنبه ۶ مهر ۱۳۸۸ ساعت 0:30 توسط H-E-G
|