درس پنجم
درس پنجم
14-P.C.I extraction
هدف از اين كار حذف پروتئنهاي موجود در محلول حاوي DNA ميباشد . فنل ( equilibrated phenol با pH بيشتر از 7.5) موجب دناتوده شدن پروتئنها ميشود و كلرفرم نيز بقاياي فنل را از محلول واكنش حذف ميكند .
1- هم حجم محلول حاوي DNA فنل اضافه كنيد و مدت 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد ( فنل متعادل شده به علت 8-hydroxyquinoline ماده آنتي اكسيدان ) زرد رنگ است و روي آن با يك لايه بافر تريس پوشانيده شده است هنگام استفاده از فنل زير بافر استفاده كنيد)
2- مايع رويي ( مايع شفاف ) را به لوله تميز ديگري انتقال دهيد ( فنل در زير قرار ميگيرد و پروتئنهاي دناتوره شده بين دو لايه قرار ميگيرند).
3- هم حجم آن از مخلوط كلرفرم - ايزو آميل الكل ( 1:24) اضافه كنيد( ايزو آميل الكل يك ماده Anti foam است و مانع كف كردن محلول ميشود ) و مانند مرحله قبل ادامه دهيد
4- مايع رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد ويا مانند روش زير ميتوان عمل نمود:
5- مخلوط فنل - كلرفروم - ايزو آميل الكل (به نسبت 1:24:25) تهيه كنيد
6- حجم مساوي از مخلوط P.C.I به محلول حاوي DNA اضافه كنيد و 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد
7- محلول رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد و هم حجم آن C.I اضافه كنيد و 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد
8- محلول رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد (محلول حاوي DNA است )
9- اگر هنوز بوي فنل از آن متصاعد ميشود مرحله 7 را تكرار كنيد.
10- DNA را با الكل رسوب دهيد( تغليظ DNA ).
15- رسوب DNA با الكل ( تغليظ DNA )
هدف از اين كار احياي DNA بعد از استخراج و يا بعد از P.C.I. extraction ميباشد و در مواقعي نيز كه DNA خيلي رقيق باشد بدينوسيله آن را تغليظ ميكنيم.
1- حجم محلول حاوي DNA را تعيين كنيد ( تخمين بزنيد )
2- استات سديم با غلظت نهايي 0.3M به آن اضافه كنيد .
3.- مقدار دوبرابر حجم آن الكل مطلق سرد ( 20- يا 70-) اضافه كنيد
4- مدت 10 دقيقه با 12000xg سانتريفيوژ كنيد . رسوب سفيد رنگ را ميتوان در ته لوله مشاهده نمود ( لازم به ذكر است كه DNA خالص تقريبا" بيرنگ است ).
5- . با وارونه كردن لوله , مايع رويي را حذف كنيد و لوله را بصورت وارونه روي كاغذ جاذب الرطوبه قرار دهيد تا آب آن حذف شود .
6- مقدار 100 ميكرو ليتر الكل 70 درجه به آن اضافه كنيد و آن را ورتكس كنيد تا رسوب DNA از ته لوله كنده شده و شناور گردد ( اگر DNA بزرگ با شد ورتكس موجب شكسته شدن آن ميشود) .
7- مدت 5 دقيقه آن را سانتريفيوژ كنيد ( شستن DNA)
الكل را خالي كرده و DNA را در 70 درجه خشك كنيد ( چنانچه در اين مرحله DNA خوب خشك نشود والكل همراه آب داخل آن بماند بعدا" براي كار كردن با آنزيمها دچار اشكال ميشويد). DNA را در مقدار بافر ( آب ) دلخواه حل كنيد .
16- احياي DNA از ژل آگارز
هدف از اين قسمت كسب مهارت براي احياي DNA از روي ژل آگارز ميباشد. اين تكنيك در بيولوژي مولكولي و مهندسي ژنتيك اهميت زيادي دارد و در كلونينگ و انتقال ژن استفاده ميشود لازم به ذكر است كه از طرق مختلف اين كار انجام ميشود مانندFreez- Squeez, paper elution, Electero elution , و... ولي فقط دو روش توضيح داده ميشود :
الف ) احياي DNA ازروي ژل توسط كاغذ ( paper elution )
1- DNA مورد نظر رابا ژل آگارز 1-2درصد الكتروفورز كنيد و اجازه دهيد تانوارهاي هاي DNA بخوبي از همديگر تفكيك شوند
2- با نور UV ( طول موج 254 نانومتر موجب آسب DNA ميشود و بهتر است از طول موج 312 نانومتر استفاده گردد ) نوارهاي مورد نظر را مشاهده كرده و جلو آن را با تيغ اسكالپر تميز علامت گذاري كنيد
3- در جلو band يك حفره ايجاد كنيد ( عرض حفره مساوي عرض band باشد )
4- يك قطعه كاغذ واتمن و يك قطعه كيسه دياليز ( dialysis tubing ) به اندازه حفره ببريد
5.- كاغذ واتمن را در جلو حفره و كيسه دياليز را در پشت كاغذ قرار دهيد
6- الكترو فورز را ادامه دهيد ( بافر تانك را كمتر كنيد بطوري كه روي ژل را نپوشاند )
7- وقتي DNA وارد كاغذ شد الكترو فورز را متوقف كنيد
8.- كاغذ را جمع كرده و به لوله 5/ ميلي ليتري كه انتهاي آن سواخ شده است انتقال دهيد
9. توسط سمپلر مقدار مناسب با فر
(150mM NaCl , 20mM Tris (pH=7.5) 1mM EDTA , 5%SDS) روي كاغذ بريزيد
10- لوله مذكور را داخل يك لوله بزرگتر قرار دهيد ( 5/1 ميلي ليتر ) ، سانتريفيوژ كنيد تا مايع از ته لوله كوچك به داخل لوله بزرگتر حركت كند ، چند دفعه اينكار را تكرار كرده تا موقعي كه ديگر DNA روي كاغذ واتمن مشاهده نشود ( با نور UV آزمايش شود )
11- اين بافر را جمع آوري كرده و با P.C.I استخراج كرده و با الكل تغليظ كنيد
ب) احياي DNA از روي ژل آگارزLow Melting Point (LMP)
1- DNA مورد نظر را با آگارز LMP 2درصد الكترو فورز كنيد و اجازه دهيد تا نوارهاي DNA خوب تفكيك شوند
2- با نور UV ( طول موج 254 نانومتر موجب اسيب DNA ميشود و بهتر است از طول موج 312 نانومتر استفاده گردد ) band مورد نظر را مشاهده كنيد
3- band مورد نظر را با تيغ اسكالپر تميز علامت گذاري كنيد
4- ژل را روي كاغذ سفيد قرار داده و band مورد نظر را بريده به لوله تميرديگر منتقل كنيد
5- قطعه ژل را يك شب در فريزر 20- درجه قرار دهيد
6- قطعه ژل را در حرارت اتاق قرار دهيد و سپس 5 دقيقه در آب 65 درجه انكوبه كنيد
7-آن را به حرارت اتاق منتقل كرده و دو مرتبه با P.C.I استخراج كنيد تا ژل از آن حذف شود
8.- استات سديم ( غلظت نهايي 0.3M ) اضافه كرده با الكل رسوب دهيد