هسته علمی ژنتیک بسیج دانشجویی

     درس چهارم    

 الكتروفورز DNA

براي تاييد انجام كارهاي مهندسي ژنتيك با يد تغييراتي كه روي  DNA ايجاد  شده است  رويت گردند، مشاهده DNA  متعافب الكتروفورز روي ژل آگارز يا پلي آكريلاميد و رنگ آميزي با اتيديوم برومايد امكان پذير خواهد بود. براي انتخاب درصد آگارز از جدول شماره 2  استفاده ميشود:

جدول شماره 2 - قدرت جداسازي مولكولهاي DNA  توسط غلظتهاي مختلف آگارز

12- تهيه  ژل  آگارز

1-  قالب ژل را آماده كنيد

2- شانه اي با دنده هاي مناسب روي قالب قراردهيد

3- حجم ژل مورد نظر را تعيين كنيد ( اندازه گيري طول وعرض قالب و قطر ژل مورد نظر )

4- پودر آگارز را وزن كنيد

5- آگارز را در بافر 1xTBE حل كنيد و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنك شدن به ازاي هر 10 ميلي ليترژل  يك ميكروليتر از محلول   10mg/ml  اتيديوم برومايد اضافه كنيد  سپس آن را خوب مخلوط كرده و داخل قالب بريزيد

1xTBE= 89mM Tris base, pH8, 89mM boric acid, 2.5mM EDTA, pH8

6- بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج كرده و داخل تانك الكتروفورز قرار دهيد

7- هر 5 ميكروليترنمونه را با يك ميكروليتر بافر نمونه مخلوط كرده و داخل چاهك هاي ژل بريزيد (اين بافر حاوي 50درصد ماده سنگين كننده مانند گليسرين يا ساكارز است كه نمونه بخوبي داخل چاهك  ريخته ميشود  و همچنين حاوي0.2 درصد از يك رنگ نشانه مانند بروموفنل بلو يا گزيلن سيانول ميباشد . رنگ برومو فنل بلودر ژل 1.5 درصد همراه با  500bp  و درژل 0.8 درصد با 1000bpحركت ميكند )

جدول شماره 3 :  مقايسه حركت رنگ نشانه و ماركر DNA   روي ژل آگارز

جدول شماره 4 :  مقايسه حركت رنگ نشانه و ماركر DNA   روي ژل  پلي آكريلا ميد

8.- بافر تانك بايد كاملا" روي  ژل  را بپوشاند و نمونه ها از داخل بافردرون چاهك ها ريخته شوند. (از بافرهاي مختلف استفاده ميگردد.   بهتر است هنگام الكتروفورز به ازاي هر ميلي ليتر بافر تانك  (TBE buffer) يك ميكرو ليتر از اتيديوم برومايد 10mg/ml  اضافه شود.

9- DNA داراي شارژ منفي است و براي الكتروفورز شدن بايد  نمونه بطرف قطب منفي با شد  تا هنگام الكترو فورز به سمت قطب مثبت حركت كند

10- تانك الكتروفورز را به منبع تغذيه وصل كنيد

11-  پيچ Current را روي ماكزيمم قرار داده و ولتاژ را تنظيم كنيد (10V/centimetr )

وقتي رنگ نشانه سه چهارم طول ژل را طي كرد ژل را از تانك خارج كرده بانورUV نتيجه را مشاهده كنيد .

13- تهيه ژل پلي آكريلاميد :

قدرت تفكيك سازي اين ژل بسيار بالا است و قطعات DNA  با طول كم نيز در اين ژل قابل رويت ميباشند و بسته به در صد ژل حتي اختلاف يك باز را ميتوان در قطعات DNA  الكتروفورز شده مشاهده نمود .

1. شيشه ها، شانه ( Comb )  و فضاسازها ( Spacer)   را با آب و دترژان خوب بشوييد و سپس با الكل 70 در صد آنهارا تميز كنيد تا چربي دستها روي آنها باقي نماند ( بجاي پنبه  از گاز استفاده كنيد زيرا پرزهاي پنبه روي شيشه باقي ميمانند ) .

2. قالب ژل را آماده كرده و جهت جلوگيري از نشت ژل ازداخل آن اطراف آن را با آگارز 1در صد به دقت درز گيري   (Seal)  نماييد .

3. حجم قالب (cast ) را  ( حجم ژل) با اندازه گيري طول وعرض قالب مشخص نماييد ( قطر ژل بسته به قطر فضا سازها يك و يا نيم ميليمتر است )

4. بسته به در صدژل مورد نظر مقدار آكريلاميد و بيس آكريلاميد لازم  را (بصورت مخلوط 29  در صد آكريلاميد و 1درصد بيس آكريلاميد تهيه و در يحچال نگهداري ميشود) داخل لوله تميز بريزيد

5. از بافر 10xTBE  با غلظت نهايي 1x  اضافه كنيد وبا آب مقطر به حجم مورد نظر برسانيد

6. مقدار 100 ميكرو ليتر آمونيوم پرسولفات 10درصد و 3 ميكرو ليتر محلول TEMED  به آن اضافه كنيد ( توجه داشته باشيد كه مونومرهاي  اكريلاميد وبيس آكريلاميد در حال پليمريزه شدن هستند)

7. به آرامي  محلول را در قالب از قبل آماده شده بريزيد و مراقب باشيد كه حباب هوا وارد آن نشود زيرا حباب هوا مانع انجام الكترو فورز ميشود .

8. به آرامي شانه را داخل قالب قرار دهيد تا بعد از پليمريزه شده ژل ، درون آن چاهك هايي جهت نمونه گذاري ايجاد شود

9. بعد از پليمريزه شده به آرامي شانه را درآورده و چاهك هارا با آب بشوييد تا اگر مونومرهاي پليمريزه نشده هنوزوجود دارد شسته شوند

10. گيره پاييني   را باز كنيد  وفضاساز پاييني   را از قالب خارج كنيد

11. گيره هاي طرفين را باز كرده و دستگاه را طوري داخل تانك مخصوص قرار دهيدكه قسمت بريده شده  شيشه رويي  ( Notch )  به سمت محفظه بالايي (  تانك  فوقاني) قرار گيرد

12. شيشه هاي دستگاه ( قالب) را با نصب گيره ها ي مخصوص به طرفين تانك ,  ثابت نماييد

13. محفظه هاي بالا و پايين تانك را با  1xTBE buffer  پرنماييد بطوريكه بافر روي چاهك ها را بپوشاند. چنانچه بين  دوشيشه قالب ( محل خارج كردن فضاساز پاييني ) كه در محفظه پاييني تانك قرار دارد حباب هوا مشاهده ميشود با يك سرنگ پر از بافر كه دار اي سر سوزن كج است حباب هوا را بيرون كنيد تا مانع جريان الكتريكي نشود و الكترو فورز بخوبي انجام گيرد

14. محصول PCR  را ( همانند الكتروفورز با ژل آگارز)  با بافر نمونه گذاري مخلوط كرده و توسط سرنگ هاميلتون نمونه گذاري را روي ژل انجام دهيد

15. محفظه بالايي تانك  را به قطب منفي ومحفظه پاييني  را به قطب مثبت منبع تغذيه وصل كرده و الكتروفورز كنيد 

16. بعد ازخاتمه الكتروفورز ( وقتي رنگ نشانه به پايين ژل رسيد) جريان برق را قطع كرده و شيشه را از تانك جدا كنيد. با يك تيغه فلزي نازك به آرامي بين دو شيشه فشار آوريد تا دو شيشه از هم جداشوند . ژل به يكي از دو شيشه مي چسبد . به آرامي آنرا  داخل آب حاوي 10 ميكروگرم درهرميلي ليتر اتيديوم برومايد قرار دهيد تا بعد از چند دقيقه ژل رنگ شود .

ژل را روي دستگاه UV Transilluminator  قرار داده و نوارهاي  هاي DNA  را مشاهده كنيد.