هسته علمی ژنتیک بسیج دانشجویی

     درس دوم    

2- بافر هاي مورد نياز در آزمايشگاه بيولوژي  مولكولي

اولين وظيفه فرد در آزمايشگاه مولكولار بيولوژي تهيه بافر هاي مورد نياز ميباشد.  همه  واكنشهاي بيولوژي در بافر مخصوص انجام ميشوند . معمولا"مواد اصلي بافر هارا در آزمايشگاه بصورت ذخيره  ((Stock   تهيه ميكنند و بافر هاي مورد نياز روزانه را  از مواد ذخيره تهيه مينمايند . بعضي از مواد ذخيره و مولاريته آنهابه اين شرح است:

براي تهيه محلول كار از مواد ذخيره از فرمول زير استفاده ميشود

M1V1=M2V2

M1 مولاريته  ماده ذخيره                          V1حجم ماده ذخيره كه بايد براي بافر برداشته شود

 M2مولاريته بافر موردنياز                         V2حجم بافرخواسته شده

مثلا" براي تهيه  50 ميلي ليتر TE  بافر  ( 10 ميلي مولار تريس و 1ميلي مولار EDTA  ) چنين عمل ميكنيم :

50x10 = ?x1000, 500:1000= 0.5cc ( 500 μl) Tris

50x1 = ? x500 , 50:500 = 0.1cc ( 100μl ) EDTA

روش كار: 500μl از بافر تريس و 100μl از  EDTA را درظرف مدرج ( لوله فالكن  ) ريخته و حجم آن را به 50ml ميرسانيم .

3- تهيه محيط  LB brothبراي كشت باكتري ( E.coli ) 

هدف از آموزش اين قسمت تهيه محيط مايع براي كشت با كتريهاي مورد استفاده در كار هاي بيولوژي مولكولي ميباشد

1- مواد زير را وزن كرده درون ارلن ماير ريخته و روي Stirrer مخلوط كنيد

تريپتون 5/2 گرم                                                سديم كلرايد5/2 گرم

عصاره مخمر25/1 گرم                                        آب مقطر250 ميلي ليتر

2- pH  محيط را مساوي 5/7-7 تنظيم كنيد  و سپس آن را اتوكلاو نماييد.  مقدار لازم  از آن را درون لوله مناسب ريخته ( در صورت نياز آنتي بيوتيك مناسب به آن اضافه نماييد )  و بصورت استريل ( كنار شعله )  يك كلني   از سلول مورد  نظر را درآن  كشت  داده ويك شب در 37 درجه آن را Shake  كنيد.

4- تهيه آگار پليت

هدف از انجام اين كار تهيه محيط كشت جامد براي كشت باكتريها ميباشد.

به محيط LB  مقدار 5/1 درصد وزني پودر آگارآگار اضافه كرده وروي شعله قرار دهيد تا خوب بجوشد  تا آگار كاملا" حل شده ومحلول شفاف بدست آيد سپس آن را اتوكلاو كنيد.

مقدار 100μg / ml  آمپي سيلين  ( يا هر آنتي بيوتيك مناسب ديگر ) به آن اضافه كنيد.

محيط را داخل چند پليت تقسيم كرده و در حرارت اتاق قرار داده تا آگار سفت شود سپس آنها  را لاي كاغذ پيچيده و تا هنگام استفاده دربرودت 4 درجه نگهداري نماييد.

اطلاعات بيشتر

5- تهيه آنتي بيوتيك هاي مورد نياز كارگاه :

الف ) 500mg آمپي سيلين ( يك ويال) رادر    5 سي سي آب مقطراستريل حل كنيد  غلظت آن100mg/ml است و هر ميكرو ليتر اين محلول حاوي 100μg آمپي سيلين است .آمپي سيلين با غلظت نهايي 100μg/ml مصرف ميشود. براي هر ميلي ليتر محيط كشت ( LB broth  يا آگار پليت ) يك ميكروليتر از اين محلول  استفاده ميشود.

ب) تتراسيكلين ( ويال يا كپسول ) را با غلظت   25mg/ml در متانول حل كنيد و در لوله هاي يك ميلي ليتري تقسيم كرده فريزر كنيد. اين آنتي بيو تيك با غلظت نهايي 12.5μg/ml  مصرف ميشود  . براي هر  ميلي ليتر محيط كشت( LB broth  يا آگار پليت )  0.5 ميكروليتر از اين محلول استفاده ميشود ( ميتوان محلول ذخيره تتراسيكلين را با غلظت 12.5mg/ml  تهيه نمود سپس براي هر ميلي ليتر محيط يك ميكروليتر از ملول ذخيره اضافه نمود).

6- تهيه سلول پذيرا ( Competent cell )

هدف ازآموزش اين قسمت كسب مهارت براي تهيه سلول باكتري است بطوري كه طي پروسه اي كه روي آن انجام ميگيرد   باكتري زنده بماند و پلاسميد (Circular DNA  ) بتواند وارد آن شود. سرما وكلسيم كلرايد و متعاقب آن شوك گرمايي ( Heat shock) كه به سلول وارد ميشود تغييراتي در سطح سلول ايجاد ميشود وDNA  پلاسميدي از طريق مناقذي كه روي سطح سلول ابجاد شده اند وارد آن ميگردد.

روش كار:

1- يك كلني از باكتري مورد نظر را در 3 ميلي ليتر محيط  LB كشت داده ويك شب در 37 درجه روي شيكرانكوبه كنيد

2. يك حجم از كشت شبانه باكتري مورد نظر رادر ده حجم محيط LB  كشت دهيد ( بنا به دلايلي كه بعدا" توضيح داده ميشود در اين كارگاهها از دو سويه HB101 و XL1-blue باكتري E.coli كه خصوصيات آنها نيز توضيح داده خواهد شد استفاده ميگردد)

3. مدت2.5ساعت در حرارت و rpm مناسب آن را Shake  كنيد تا به OD600 = 0.6 برسد

4. مقدار يك ميلي ليتر آن را به لوله ميكروفيوژ انتقال دهيد

5. لوله حاوي سلول را ده دقيقه  روي يخ قرار دهيد

6. مدت 5 دقيقه با 3500rpm  سانتريفيوژ كنيد ( بهتر است در 4درجه انجام شود )

7. مايع رويي را خالي كرده ولوله را وارونه روي كاغذ جاذب الرطوبه قرار دهيد تا آب آن خارج شود

8. رسوب را بايك سوم حجم اوليه از محلول  100mM CaCl2  سوسپانسيون كنيد ( محلول نبايد ورتكس شود بلكه با ضربه انگشت آن را حل كنيد) و ده دقيقه روي يخ قرار دهيد

9. مانند مرحله 5 آن را سانتريفيوژ كرده محلو ل رويي را خالي كنيد

10. رسوب را با يك دوازده ونيم حجم اوليه  محلول CaCl2 سوسپانسيون كنيد ( با ضربه دست )

آن را درون ميكروفيوژ هاي مناسب تقسيم كرده وبراي Transformation  استفاده كنيد.

7-  Transformation ( انتقال Plasmid DNA به باكتري زنده )

هدف از آموزش اين قسمت كسب مهارت لازم براي انتقال پلاسميد به سلول باكتري ميباشد . اين كار در بيولوژي مولكولي از اهميت بالايي بر خوردار است . براي كار كردن با ژنها  بايد حتما" آن ژن در يك پلاسميد كلون شود و سپس پلاسميد نوتركيب (Recombinant plasmid) به سلول  باكتري منقل شود تاپس از همانند سازي پلاسميد، ژن ( DNA ) كلون شده در پلاسميد نيز به تبع آن همانند سازي كند .

1. سلول پذيرا ( Competent cell ) را روي يخ قرار دهيد

2. Plasmid DNA  مورد نظر را   (5ng) به آن اضافه كرده خوب مخلوط كنيد ( بنا به دلايلي كه بعدا" توضيح داده ميشود دراين كارگاهها از دوپلاسميد pBR322 وBluescript  كه خصوصيات آنها نيز توضيح داده خواهد شد استفاده ميگردد)

3. - لوله حاوي سلول پذيرا ( Competent cell ) را مدت 30 دقيقه روي يخ قرار دهيد

4.- واكنش را مدت 40 ثانيه در آب گرم 42 درجه قرار دهيد ( شوك گرما )

5.- مدت 2-1 دقيقه روي يخ قرار دهيد

6-. مقدار 200  ميكروليتر محيط LB  ( بدون آنتي بيوتيك) به آن ضافه كرده و 60-40 دقيقه در 37 درجه انكوبه كنيد (باكتر ي  E.coli هر 20 دقيقه يك نسل تكثير ميكند ودر اينجا به آن فرصت داده ميشود تا  دو يا سه نسل تكثيرنمايد )  . .

7- بصورت زير روي  آگار پليت پخش كنيد ( توجه : همه محتواي لوله را روي پليت خالي كرده و با Spreader آن را روي سطح آگار داخل پليت پخش كنيد):

پليتA :    Competent cell+ plasmid DNA و آنتي بيوتيك مناسب

  پليت: B    Competent cell ( آگار حاوي آنتي بيوتيك است )

پليتC :  Competent cell  ( آگار فاقد آنتي بيوتيك است  )

8.-  پليت را به انكوباتور منقل كرده ودرب آنها را نيمه باز بگذاريد تاسطح پليتها خشك شود

9- . پليت هارا بصورت  وارونه يك شب در حرارت 37 درجه انكوبه كنيد

10- اگر پروسه كار خوب انجام شده باشد بعد از 12 ساعت روي سطح پليت كلني ها ظاهر ميشوند

11-  تفسير نتايج : اگر كار درست انجام شده باشد بايد روي پليت هاي A  و C كلني باكتري رشد كرده باشد ولي روي پليت B كلني باكتري مشاهده نگردد  رشد كلني باكتريايي روي پليت B  به اين معني  است كه باكتري مورد استفاده قبلا"با يك پلاسميد حاوي ژن  مقاومت به آنتي بيوتيك ترانسفرم شده است  در اينصورت كلني هايي كه روي پليت A ظاهر شده اند فاقد اعتبار ميباشند  . اگر روي پليت C   كلني  با كتر ي رشد نكند به اين معني است كه Competent cell  خراب بوده و باكتريها در طول پروسه كار مرده اندو نبايد انتظار داشته با شيم كه روي پليت A  هم كلني   باكتري  رشد كند .كلني هاي باكتريايي كه روي  پليت A رشد ميكنند كلني هاي حاوي پلاسميد مورد نظر هستند.

 انيميشن كلونينگ